科學研究

《科学进展》杂志发表複旦大學丁琛、贺福初团队最新成果研发精密解析染色質开放区域蛋白質-DNA转录機器的“工具包”

  時間:2021-10-25   來源:人類表型組研究院   點擊:376
 

北京時間2021年10月23日,國際權威學術期刊《科學》(Science)雜志子刊《科學進展》(Science Advances)在线发表了遗传工程国家重点实验室,複旦大學生物醫學研究院、人类表型组研究院、生命科学学院丁琛/賀福初團隊有關蛋白質-DNA轉錄機器的最新研究成果:“轉座子生物素化的可接近性染色質上的轉錄調控蛋白質機器(Proteome-wide profiling of transcriptional machinery on accessible chromatin with biotinylated transposons”。该成果显示,複旦大學团队在世界范围內首次实现了染色質开放区转录蛋白機器的鉴定及功能研究。

转录调控蛋白質機器由转录因子(transcirption factor,TF)、转录辅助因子(transcirptional coregulator TC)等构成,其在几乎所有生物学进程(如分化、发育、细胞周期控制和细胞凋亡等)中都发挥着关键作用。基因的转录过程依赖于转录调控蛋白質機器與DNA结合并行使相应功能,二者的结合是基因启动转录的前提。真核生物基因组中的染色質有一些区域经染色質重塑后呈现出松散的状态,这部分 DNA 区域被称为开放染色質open chromatin)或可接近性染色質accessible chromatin),而染色質是否呈疏松结构,是蛋白質機器與DNA是否互作的關鍵因素之一。

在基因组层面,2013年,斯坦福大学的Howard Chang教授开发了ATAC-seq技术Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing),可以通过高通量测序获得染色質开放区和基因组中活跃转录的调控序列的关键信息。

而在蛋白質組水平,由于轉錄因子和轉錄共調節因子表達豐度低且缺乏相關富集技術,科學界仍然難以對上述蛋白分子與染色質開放區的結合配對關系進行全景式的精細解析。

多年来,複旦大學生物醫學研究院、人类表型组研究院丁琛/賀福初團隊,聚焦這一難題持續開展科研攻關。早在2013年,丁琛/秦鈞團隊開發catTFRE技術,首次設計合成了串聯各種轉錄因子的多拷貝雙鏈DNA結合元件,從核蛋白中富集具有DNA結合活性的內源轉錄因子及其複合物,對開展轉錄調控具有重大價值。

在本次發表的最新成果中,科研人員基于ATAC-seq技術,開發出直接富集和定量內源性染色質開放區域實時原位轉錄的轉錄蛋白機器的新方法ATAC-MS(圖1)。該技術利用生物素化的高活性Tn5轉座子,特異性結合染色質開放區暴露的DNA,將DNA片段化並進行生物素(biotin)標記。而後通過鏈黴親和素偶聯的磁珠與生物素化的DNA反應,分離純化DNA及DNA上結合的轉錄複合物。對上述複合物分別進行蛋白質酶解-肽段純化與DNA純化-文庫構建,可用于平行的質譜鑒定與二代測序分析,由此可直接觀測獲得轉錄調控蛋白質機器信息及其結合序列motif信息。


1. ATAC-MS原理示意圖

該方法在使用低5×105的細胞量時,便可對轉錄因子和轉錄共調控因子的鑒定有著较好的灵敏性和特异性(圖2)。ATAC-seq檢測到轉錄因子結合序列不同,ATAC-MS可以直接捕獲轉錄因子(TF)及與之共同作用的转录复合物。


2. ATAC-MSTF、TC的檢測靈敏度檢測


使用腫瘤壞死因子(TNF-α)HeLa細胞進行刺激後,ATAC-MS成功鑒定到轉錄因子NFKB家族及與其相互作用的TFs的变化(圖3)。此外,使用雌激素受體17β雌二醇(E2)及其拮抗物4-羟基他莫昔芬(4-Hydroxytamoxifen)刺激MCF7細胞時,ATAC-MS不僅能檢測到核心轉錄因子ESR1的變化,還能觀測到E2的刺激导致與ESR1共同作用转录共激活因子(coactivator),如NCOA3EP300等的富集。而在4-HT的刺激下,轉錄共抑制因子(corepressor)NCOR1, HDAC2等也可被ATAC-MS成功捕獲。这证实了對于转录共调节因子的高富集能力是ATAC-MS技術的優勢。


3. ATAC-MS檢測TNF-α刺激應答轉錄因子複合物

 

圖4. ATAC-MS檢測E2、4HT刺激應答轉錄共調節因子複合物

 

進一步的,該團隊將ATAC-MS技术與阴离子交换技术结合,开发出高分辨率ATAC-MS解析技術(fractionation ATAC-MSfATAC-MS)。利用不同濃度鹽溶液洗脫,將DNA-轉錄機器複合物分成不同組分,降低複雜度,提供更高分辨率的轉錄蛋白-DNA圖谱。实验显示,不同组分中的共洗脱蛋白質/DNA成分显示出特征性的功能和特征性的DNA结合基序。一些具有保守功能的蛋白質複合物,如RNA聚合酶II相關蛋白和染色質修飾酶(HDACs等)在所有组分中被广泛洗脱簣D定。这些发现显示了fATAC-MS在全基因組範圍內進行高分辨率蛋白質機器-DNA互作關系解析的應用潛能(圖5)。這展示了ATAC-MS可用于在全基因組水平繪制蛋白-DNA转录调控复合物圖谱。


5. 高分辨率ATAC-MS解析技術(fATAC-MS)原理示意圖

 

進一步的,作者設計並表達了一種新型Tn5-dCas9融合蛋白,將ATAC-MS升級爲具有靶向性的ctATAC-MS(dCas9 targeted ATAC-MS)。在没有sgRNA的情况下,Tn5-dCas9融合蛋白作为Tn5转座子與开放染色質结合,由此可用于全基因组水平的转录调控蛋白質機器;而在有sgRNA的指导下,Tn5-dCas9對特定靶向的DNA序列具有亲和力,可精确揭示特定位点的转录调控蛋白質复合物。升級的ctATAC-MS方法系統地描述了在小鼠肝髒晝夜節律時鍾中靶向E-box的轉錄過程,揭示了不同轉錄因子在晝夜節律中的潛在機制(圖6)。

 

6. 靶向ATAC-MS(ctATAC-MS)原理示意圖

 

综上,複旦大學丁琛/賀福初團隊本次发表的研究提供了一个包括3种全新方法——ATAC-MS、fATAC-MS和ctATAC-MS在內的轉錄調控複合物解析“工具”,使得我们既能够在全基因组层面绘制活跃的转录调控蛋白質機器圖谱,也可以在特定基因组位点上探究蛋白質-DNA转录调控复合物。该工具包将使该领域的研究人员能够深入挖掘不同层次的转调控机制,并具有兼顾体/体外反应的特点,在临床活检、多种组织标本檢測和不同物种检验等领域具有广泛的应用潜能。

該研究得到上海市市級科技重大專項“國際人類表型組計劃(一期)”的支持。複旦大學生物醫學研究院2017级博士生张海珠、複旦大學人类表型组研究院副研究员秦兆宇、複旦大學生物醫學研究院2018級博士生嶽雪彤爲本文共同第一作者。上海交通大學醫學院附屬新華醫院楊雯隽研究員,中国科学院院士、遗传工程国家重点实验室和複旦大學生物醫學研究院特聘PI及人类表型组研究院特聘导师贺福初教授,複旦大學人类表型组研究院副院长、遗传工程国家重点实验室、生命科学学院及生物醫學研究院丁琛研究员为该论文的共同通讯作者。

原文鏈接:https://doi.org/10.1126/sciadv.abh1022

 
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